تست MTT چیست؟

محلول MTT زرد رنگ قابل‌ نفوذ در غشا سلول ها است که توسط انزیم ردوکتاز میتوکندری سلول‌های زنده به یک ماده بنفش رنگ به نام فورمازان احیاء می‌شود و امکان سنجش تکثیر سلولی و میزان زنده ماندن سلول را فراهم می‌کند. از تیازولیل بلو به‌ عنوان یک شاخص مستقیم سمیت سلولی (مانند غربالگری داروهای سرطانی) و آپوپتوز استفاده می‌شود.

محلول زرد رنگ پودر MTT  توسط دهیدروژنازهای میتوکندری سلول‌های زنده به فرم MTT فورمازان و غیرمحلول در آب تبدیل می‌شود. کریستال‌های بنفش در DMSO یا ایزوپروپانول اسیدی حل شده و شدت جذب نوری آن در 540 یا 570 نانومتر اندازه‌گیری می‌شود. MTT یا تیازولیل بلو تترازولیوم بلو به‌عنوان معرف در هیستوشیمیایی/سیتوشیمیایی و برای تشخیص نیکوتین‌آمید آدنین دی‌نوکلئوتید NAD استفاده شده است. سیستم‌های آنزیمی مرتبط با آدنوزین دی‌فسفات ADP در بافت به دلیل اتصال کاتیون توسط شلاتور سیانید، با تیازولیل بلو تترازولیوم بلو قابل تشخیص نیستند.

میزان جذب این محلول رنگی را می توان با اندازه‌گیری در یک طول موج خاص (معمولاً بین 500 تا 600 نانومتر) توسط دستگاه اسپکتروفتومتر اندازه‌گیری کرد. میزان جذب نور به‌شدت غلظت فرمازان جمع شده در داخل و سطح سلول بستگی دارد. هرچه غلظت فورمازان بیشتر باشد، رنگ بنفش بیشتر و در نتیجه جذب بیشتر می‌شود.

 کاربرد

پودر MTT یا تیازولیل بلو تترازولیوم بلو (Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide) در موارد زیر استفاده شده است:

• تیازولیل بلو تترازولیوم بروماید به‌عنوان یک شاخص فعالیت متابولیکی رنگ سنجی در سنجش‌های زنده ماندنی سلول استفاده شده است.
• پودر MTT  همچنین برای تعیین تکثیر سلولی استفاده می‌شود. 

تهیه و ساخت محلول MTT

5mg از پودر MTT به یک میلی لیتر محلول PBS افزوده شده و با همزن مغناطیسی تا حد امکان حل میشود. برای جلوگیری از تبخیر ظرف دربسته این کار انجام شود محلول حاصل از فیلتر ۰/۲۲ عبور داده شده و سپس در حجم های کم تقسیم و در منفی 20 درجه سانتیگراد نگهداری شوند. با توجه به حساسیت MTT به نور بهتر است در لوله های تیره نگهداری شوند و یا سطح لوله ها با فویل آلومینیمی پوشیده شوند.

 فاکتورهای مؤثر در MTT عبارتند از:

1. تعداد سلول: تعداد سلول بر حسب نوع سلول متفاوت است. معمولاً برای انواع سلول های هیبریدوما، سلول های توموری و فیبروبلاست، تعداد ۱۰^۳×۵ سلول برای هر حفره استفاده میشود اما به کارگیری سلول کمتر تا حدود ۱۰۰۰ سلول نیز قابل قبول است. هر چه تعداد سلول بیشتر باشد جذب نوری بالاتر خواهد بود و باید دقت کرد که اگر تعداد سلول بالاتر از حد لازم باشد باعث خطا در آزمایش خواهد شد.

2. غلظت MTT: غلظت رنگ بسته به نوع سلول متفاوت است. بنابراین بسته به نوع سلول غلظت باید ارزیابی شود. معمولاً غلظت1 تا 5 mg/ml مورد مصرف قرار میگیرد.

3. مدت انکوباسیون: معمولاً ۲۴ ساعت انکوباسیون سلولها همراه با رنگ کافی است.

4. نوع حلال: از حلال ایزوپروپانل اسیدی و یا از حلال DMSO همراه با بافر گلایسین NaCl و ۱۰/۵=pH استفاده میشود. حلالیت فرمازان تولید شده با ایزوپروپانل کمتر بوده و همچنین رنگ حاصل به دلیل تبخیر سریع ایزوپروپانل پایدار نیست در صورتی که حلالیت با DMSO بسیار بیشتر و رنگ حاصل نیز پایدارتر است.

5. اثر بافر NaCl گلایسین بر افزایش حلالیت: مطابق مطالعات جذب نوری در حضور بافر گلایسین همراه با DMSO بیشتر از DMSO به تنهایی است.

6. اثر pH بافر گلایسین بر حلالیت فرمازان: اگر فرمازان تنها در DMSO حل شود دارای دو جذب ماکزیمم است و در صورتی که pH افزایش یابد منحنی به سمت راست متمایل میشود و فقط یک جذب ماکزیمم میدهد.

روش انجام تست MTT

تست MTT به صورت تکرار سه تایی مطابق مراحل زیر انجام میشود

1. تهیه سوسپانسیون سلولی در رقت مناسب از سلولها که با شمارش سلولی حاصل میشود
2. افزودن مقدار ۲۰۰ میکرولیتر از سوسپانسیون سلولی به هر حفره از پلیت ۹۶ خانه ای کشت سلولی برای این که در هر حفره تقریبا تعداد ۱۰۳×۵ سلول قرار گیرد، انجام تست تریپان بلو و شمارش تعداد سلولها ضروری است.
3.  انکوباسیون به مدت ۲۴ ساعت برای اطمینان از چسبیدن سلولها  به بستر در انکوباتور ۵CO و با رطوبت ۱۰۰%
4.  پس از ۲۴ ساعت محیط کشت را از حفرات خارج کرده و اگر سلولها به حفرات چسبیده باشند میتوان با وارونه کردن پلیت این کار را انجام داد و اگر سلولها معلق باشند با استفاده از سانتریفوژهای مخصوص پلیت این کار انجام میشود. سپس ۲۰۰ میکرولیتر محیط کشت تازه به هر خانه اضافه شود.
5. به هر حفره ۲۰ میکرولیتر محلول رنگ MTT اضافه میشود پلیت در فویل آلومینیومی پوشیده شده و به مدت چهار ساعت در انکوباتور انکوبه می شود.
6. پس از طی زمان، محیط کشت سلولها را خالی کرده و به هر حفره ای ۱۰۰ میکرولیتر از DMSO و ۱۰ میکرولیتر بافر گلایسین اضافه میکنیم. 
7. با سمپلر محیط و سلولها را خوب مخلوط میکنیم تا رنگهای تولید شده حل شوند.
8. جذب نوری هر ،حفره توسط اسپکتروفتومتر در طول موج ۵۷۰nm قرائت می شود.
9.  در مقایسه با شاهد و کنترلهای مثبت و منفی میتوان منحنی های مربوطه را رسم نمود.

• این روش به خصوص برای بررسی آثار سمی مواد و داروها بر روی سلولها کارآیی دارد.

روش انجام تست MTT
1. کشت و انکوباسیون سلول‌ها در پلیت 96 خانه
به هر چاهک 100 میکرولیتر محیط کشت حاوی سلول اضافه کنید و به مدت 2روز انکوبه کنید.
توجه: از تراکم سلولی ثابت استفاده کنید که 5000 تا 10 هزار سلول در هر چاهک باشد.
توجه: زمان انکوباسیون بسته به رده سلول و تراکم سلول متفاوت خواهد بود.
2. محلول استوکMTT را تهیه کنید.
5 میلی‌گرم MTT را در 1 میلی‌لیتر X PBS 1حل کنید. با فیلتراسیون استریل کنید.
3. برچسب زدن سلول‌ها با MTT
به هر چاهک 10 میکرولیتر محلول استوک MTT اضافه کنید.
به مدت 2-5 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد به دور از نور انکوبه کنید.
بدون ایجاد مزاحمت برای سلول‌ها، محتوا را با احتیاط از هر چاهک خارج کنید.
4. به هر چاهک 100 میکرولیتر دی متیل سولفو اکسید DMSO اضافه و پیپتاژ کنید تا خوب مخلوط شود.
به مدت 15 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی‌گراد انکوبه کنید.
5. میزان جذب را اندازه‌گیری کنید
بلافاصله جذب را در 570 نانومتر اندازه‌گیری کنید.