کیسه دیالیز آزمایشگاهی چیست؟  

کیسه یا غشای دیالیز نوعی لوله غشایی نیمه تراوا است که از سلولز، استات سلولز یا سلفون ساخته شده است، این غشاها برای انتشار از قانون اسمز استفاده کرده و به مولکول های کوچکتر اجازه عبور داده در حالی که مولکول های بزرگتر در ان باقی می مانند. کیسه دیالیز عموما جهت جداسازی مولکول های زیستی از جمله پروتئین ها و DNA یا نمونه های بیولوژیکی پیچیده مانند خون یا سرم استفاده می شود. کیسه های دیالیز با وزن مولکولی MWCO (به عنوان کوچکترین وزن مولکولی ماکرومولکول های زیستی باقی مانده در کیسه دیالیز) قطر منافذ  100 ,500 ,1000 ,2000 ,3500 ,8000 ,10000, 12000 ,14000 ,25000 ,50000 ,100000 ,200000 ,1000000 KD کیلو دالتون و با عرض های از ۸ میلی متر تا ۷۷ میلی متر تولید می شوند.این کیسه ها قابلیت اتوکلاو داشته و می‌توان از آن مجدداً پس از اتوکلاو استفاده کرد. برای جلوگیری از خشک شدن و ترک خوردن غشاهای دیالیز انها را با گلیسیرین ۱۰٪ تیمار می کنند. کیسه های دیالیز حاوی مقادیر بسیار کمی سولفید، فلزات سنگین و برخی ناخالصی ها با جذب فرابنفش هستند که برای پروتئین ها، DNA و دیگر مواد فعال بیولوژیکی مضر هستند و باید قبل از استفاده حذف شوند.

فرآیند دیالیز چست؟

دیالیز امکان جدا شدن مولکول‌های کوچک از مولکول‌های بزرگ یا تعویض محیط را فراهم می‌کند. این تکنیک، یکی از قدیمی‌ترین روش‌ها برای جداسازی ترکیبات دارای وزن مولکولی کم از یک محلول و مبادله آن‌ها با بافر است. اساس این روش از خصوصیات غشاهای نیمه تراوا که بین محلول پروتئین و بافر دیالیز قرار می‌گیرد، ناشی می‌شود. این غشای نیمه تراوا که معمولا از جنس غشا سلولز دارای حفره است به ملکول‌های کوچک‌تر، اجازه عبور داده و از نفوذ ماکرومولکول‌ها از خلال آن جلوگیری می کند. ملکول‌های دارای ابعاد بزرگ‌تر از قطر منافذ کیسه دیالیز، در داخل کیسه دیالیز محبوس شده و ملکول‌های کوچک‌تر و یون‌ها، از این منافذ عبور می‌کنند و از کیسه خارج می‌شوند. این تکنیک برای خارج کردن یک نمک یا سایر ملکول‌های کوچک نیز مفید است. 

عملکرد دیالیز به خاطر تفاوت غلظت ترکیبات در دو طرف غشا بوده و هرگاه غلظت ترکیبات مورد نظر در دو طرف غشا یکسان شـود، تـعـداد ملکول‌های مـبـادله شونده از دو سمت غشا نیز به تعادل رسیده و فرایند دیالیز نیز بـه مـرحـله پایان خود می‌رسد. بنابراین در این مـرحـلـه بـا تـعـویـض بـافـر دیـالـیـز، کاهش بیشتر غلظت ترکیب مورد نظر در یک محلول پروتئینی امـکــان پــذیــر مــی‌شـود. پـس از چـنـدیـن مـرتـبـه تعویض محلول بافر، شرایط داخل کیسه دیالیز از قبیـل غلظـت، PH و … همـاننـد محلـول بـافـر اطـراف آن خواهد شد. به عنوان مثال، ممکن اســت کــه از دیـالـیـز بـه مـنـظـور خـارج سـاخـتـن سولفات آمونیوم از پروتئین استفاده شود. تعویض بافر دیالیز نسبت به حجم تام بافر، اهـمیـت بیشتـری دارد. سـرعـت عمـل دیـالیـز بـا افزایش نسبت سطح غشا به حجم محلول، بیشتر می‌شود. از طرف دیگر، افزایش سطح با کاهش بـازیـافـت پـروتـئـیـن هـمـراه اسـت. زیـرا هـمـواره مقـداری از پـروتئیـن جـذب غشـا دیـالیز شده و بـدیـن طریق از دست می‌رود. بنابراین بایستی میان سرعت دیالیز و بازیافت پروتئین مورد نظر سازگاری وجود داشته باشد. میزان انتشار و جابجایی ملکول ها، به دما و ویسکوزیته محلول بستگی دارد. اگر چه با افزایش دما، میزان انتشار نیز افزایش می‌یابد اما در اغلب موارد، ثبات پروتئین در دمای 8-4 درجـه سـانتیگـراد اسـت. از ایـن رو، فـراینـد دیـالیـز را در سـردخـانـه انجـام داده و محلول‌های با ویسکوزیته بالا را نیز قبل از انجام فرایند دیالیز، رقیق می‌کنند.

نحوه اماده سازی و فعال سازی کیسه دیالیز

براي آماده کردن كيسه‌های دياليز، روش‌های گوناگونی وجود دارد كه در ذیل به دو روش از آن‌ها اشاره مي‌شود.

روش اول

بعد از برش كيسه‌ دياليز در اندازه های مورد نیاز، آن‌ها را در يك بشر حاوی محلول بيكربنات سديم 2% و EDTA یک ميلي مولار، غوطه ور كرده و به مدت 10 دقيقه مي‌جوشانيم. پس از خنك شدن محلول، كيسه‌های دياليز را با آب مقطر دو بار شستشو داده و سپس به مدت 10 دقيقه در محلول  EDTA یک ميلی مولار مي‌جوشانيم. پس از اتمام زمان جوش و خنك شدن محلول، كيسه‌هایدياليز آماده استفاده هستند.

روش دوم

كيسه‌های دياليز را به یک ظرف 4 ليتری انتقال داده و سـپس 2 ليتر محلول بيكربنات سديم 100 ميلي مولار و EDTA دی سدیمی 10 ميلي مولار كه PH آن ها را به 7 رسانده‌ايم به آن ها اضافه مي‌كنيم. سپس در ظرف را پوشانده و در بن‌ماری شيكر دار به مدت يك ساعت در دماي 60 درجــه ســانـتـيـگــراد بـه مـلايـمـت تکان داده می شوند. سپس محلول درون بشر را با 2 ليتر آب مقطر تعويض كرده و كيسه دياليز را به مدت يك سـاعـت در آن نگـه مـي‌دارنـد. در صورت كدر شــدن آب مـقـطــر بــايــد آن را بـا آب مقطـر تـازه جايگزين كرد و اين كار را تا شفاف باقی ماندن آب مقطر بايستي ادامه داد.

نگهداری كيسه‌های دياليز

كيسه‌های دياليز آماده را مي‌توان در آب مقطر حاوي كلروفرم 1/0 درصد و در دماي 4 درجه سانتيگراد نگهداری كرد. گاهي از سديم آزيد 2 درصـد نـيـز اسـتـفـاده مـي‌شـود كـه مـعمولا مشكلي ايجاد نمي‌كند و از رشد باكتریها نيز جلوگيری مي‌كند.

نحوه استفاده از كيسه‌ دياليز

تغيير دمای محلول حاوی كيسه دياليز بايد به صورت تدريجی بوده و از تغيير دمای محلول به صــورت نــاگـهــانــی خــودداری كــرد. تـغـيـيـرات ناگهانی دما موجب تغيير در اندازه روزنه‌های كيسه‌های دياليز مي‌شود. در هنگام كار كردن با كيسه‌های دياليز به منظور جلوگيري از آلودگی آن‌ها با پروتئازها بايد از دستكش استفاده كرد. داخل و خارج كيسه دياليز را قبل از استفاده بايد با جرياني از آب مقطر شستشو داد.

مراحل انجام دياليز

بــــراي انـجـــام فرایند ديـــالـيـــز، ابـتـــدا انـتـهـــای كيسه‌های دياليز را به وسيله گره زدن يا استفاده از گـيـره‌هـای غشا دیالیز، بـه صورتی كـه نـشـتـی نـداشتـه بـاشد می بندیم. سپس محلول مورد نظر را درون كيسه‌ ديـاليـز ریخته و سـر كيسـه‌هـا را نيـز مـانند انتهاي آن‌ها می بنديم. اين كيسه‌ دياليز پر شده از محلول را در بافر دياليز غوطه ور می کنیم. كيسه‌هاي دياليز بايستي در ظرفي كه حاوي مگنت بوده و بر روي Stirrer قرار گرفته است، قرار داده شوند و به مدت 24 ساعت، فرايند دياليز انجام شود. در صورتي كه آب مقطر درون ظرف به نظر کدر برسد، بايستي با آب مقطر تازه جایگزین شود.

نحوه استفاده از كيسه‌ دياليز برای دیالیز DNA

کیسه های دیالیز برای نمک زدایی و خالص سازی DNA قابل استفاده می باشند برای این منظور باید از کیسه دیالیز با اندازه cut-off 6000-8000 استفاده شود. این کیسه ها باید قبل از استفاده آماده و مرطوب شوند.

مراحل خالص سازی DNA با استفاده از کیسه های دیالیز:

1. شستشو در 60 درجه سانتیگراد به مدت ۳۰ دقیقه در حجم بالایی از سدیم بی کربنات ۲ درصد (حدود یک لیتر) حاوی یک درصد EDTA

2. شستشوی غشاهای دیالیز با آب مقطر

3. نگه داری غشا در 4 درجه سانتی گراد و در محلول فرمالدئید ۱ درصد و سدیم بنزوات ۱ درصد یا سدیم آزید ۱ درصد در آب مقطر دیونیزه یا اتانل ۱۰۰ درصد

4. حرارت دادن غشاهای دیالیز در دماهای بالاتر از 80 درجه سانتی گراد سبب کاهش تراوایی غشاها میشود.

5. برای ممانعت از چسبندگی پروتئین های باردار به غشا بهتر است در محلول BSA  ۰/۰۵ در بافر تریس خیسانده شوند.

کیسه دیالیز آزمایشگاهی چیست.docx

Applications

Properties

All VISKING, SERVAPOR and MEMBRA-CEL dialysis tubings are made of regenerated cellulose. They show good chemical resistance against numerous solvents, e.g.:

• Alcohols• Esters• Ketones• Hydrocarbons• Halogenated hydrocarbons• Formic acid, acetic acid, diluted strong acids (e.g. 5% HCl)• Dimethylsulfoxide, Pyridine• 30% hydrogen peroxyde• Silicon oilThey are not ressistant against strong acids and strong alkalis.The tubings are stable between pH 5 – 9 and can be stored for long term in this range, provided microbial degradation is prevented (see below). Dialysis (1 – 2 days) can even be performed in the pH range of 2 – 12.The tubings can be sterilized by autoclave. Once moistened, shey should not be allowed to dry out unless reglycerinated. Tubings containing aqueous solutions can be frozen.All dialysis tubings made on the basis of cellulose are sensitive against Cellulase and Cellulase producing microorganisms, especially when moistened. Therefore they have to be stored refrigerated in aqueous media supplemented with 0.05% Na-azide or other anti-microbial substances.VISKING and SERVAPOR dialysis tubings have a molecular weight cutt-off (MWCO) of 12000 – 14000, that means: proteins of this size are excluded from the membrane at about 90% and do not penetrate through the pores. Beside the molecular weight, the three-dimensional form, the charge and the state of hydration are important factors which influence the penetration of a protein through the membrane. To be sure that5proteins do not diffuse through the membrane into the outer medium, one should not select a MWCO of the tubing which is closely below the molecular weight of the protein.MEMBRA-CEL have  a MWCO of 3500 and 7000.Adsorption of protein is below 1 ng/g dry weight of the tubing.HandlingTo avoid contamination (e.g. with nucleases), tubings should only be touched with gloves.The tubings are delivered dry. They are treated with glycerol as humectant to prevent them from drying out. Due to the manufacturing process, they contain traces of heavy metals (<50 ppm) and sulfur compounds (<0.3%). For most biochemical applications, it is suggested to remove these compounds by boiling and washing. Several methods have been described in the literature, e.g.:1) Boiling successively (each time 15 minutes) in 5% Na2CO3, 50 mM EDTA pH 8,and dist. water; between each step, the tubings have to be rinsed with dist. water(Meth. Enzymol. XX, 1971, p. 72).2) Boiling 30 minutes in 10 mM EDTA pH 7.5. Storage at 4° C in 1 mM EDTA pH 7.5(Meth. Enzymol. XXX, 1974, p. 4253) Heating to 70° - 80° C for 2 hours in heavy metal free water with occasional gentlestirring. The water is decanted and this procedure is repeated 3 more times. Thetubings are stored in heavy metal free water or in water with Na-azide (Meth.Enzymol. 158, 1988, p. 13).It is advisable to prepare a larger stock in one of these ways and to store it in the refrigerator. Before use, tubings have to be thoroughly washed with dist. water. The samples are filled with a pipette into the tubings – closed at the lower end with a clamp. Closing by knots is not recommended, as it may damage the membrane and result in loss of material during dialysis.As the volume of the protein solution will increase during the dialysis process due to penetration of water, the tubing should be filled only by 2/3.For dialysis, the tubing, closed on both ends, is placed into a sufficiently large vessel filled with buffer and stirred on a magnetic stirrer. Depending on the concentration gradient and the requirements of the following procedures, we recommend 1 – 3 buffer exchanges.
 کیسه دیالیز.pdf