بررسی کمیت سلول ها به روش  MTT assay protocol

Tetrazolium assay یا تست MTT یک روش برای بررسی میزان سیتوکسیتی داروها یا مواد سمی بر پایه رنگ سنجی می باشد. میتوکندری سلول های زنده دارای متابولیسم اکسیداتیو بوده و در صورت نفود تترازولیوم زرد رنگ به داخل سلول انرا به رنگ فورمازان بنفش رنگ غیر محلول احیا می کنند. این رنگ نامحلول با موادی از قبیل دی متیل سولفوکساید یا ایزوپروپانول به شکل محلول در امده و از سلول ها خارج می شود و می توان میزان جذب نوری انرا با دستگاه الایزا ریدیر اندازه گیری کرد. با اندازه گیری میزان جذب نوری گروه کنترل و گروه تست و مقایسه انها با هم می توان میزان فعایت متابولیک سلول ها را مشخص نمود.

پروتکل و روش تهیه محلول MTT

5mg از پودر MTT  به یک میلی لیتر محلول PBS افزوده شده و با همزن مغناطیسی تا حد امکان حل شود برای جلوگیری از تبخیر حتما در ظرف دربسته این کار انجام شود محلول حاصل از فیلتر 0.22 میکرون عبور داده شده و سپس در حجمهای کم تقسیم و در ۲۰- سانتیگراد نگهداری شوند. با توجه به حساسیت MTT به نور بهتر است در لوله های تیره نگهداری شوند و یا سطح لوله ها با فویل آلومینیمی پوشیده شوند.

MTT نمک زرد رنگ تترازولیوم محلول در آب است. وقتی این ترکیب در محیط محلول نمکی فاقد فنل رد قرار گیرد محلول زرد رنگی حاصل می.شود این ترکیب در میتوکندری سلولهای زنده توسط آنزیم دهیدرژناز تبدیل به ترکیب نامحلولی به بنفش رنگ نام فرمازان میشود که این محصول توسط حلالهایی مانند ایزوپروپانل اسیدی یا DMSO حل شده و رنگ ارغوانی بنفش را ظاهر میسازد جذب این رنگ در طول موج ۵۷۰ نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر یا دستگاه قرائت کننده ی پلیت الیزا اندازه گرفته میشود 

فاکتورهای مؤثر در تست MTT عبارتند از :

1- تعداد سلول: تعداد سلول بر حسب نوع سلول متفاوت است. معمولا برای انواع سلولهای هیبریدوما سلولهای توموری و فیبروبلاست، تعداد 10³*5 سلول برای هر چاهگ استفاده میشود اما به کارگیری سلول کمتر تا حدود ۱۰۰۰ سلول نیز قابل قبول است. هر چه تعداد سلول بیشتر باشد جذب نوری بالاتر خواهد بود و باید دقت کرد که اگر تعداد سلول بالاتر از حد لازم باشد باعث خطا در آزمایش خواهد شد.

2- غلظت MTT: غلظت رنگ بسته به نوع سلول متفاوت است. بنابراین بسته به نوع سلول غلظت باید ارزیابی شود. معمولا غلظت 5mg/ml مورد مصرف قرار میگیرد. 

3- نوع حلال: معمولاً از حلال ایزوپروپانل اسیدی و یا از حلال DMSO همراه استفاده میشود. حلالیت فرمازان تولید شده با ایزوپروپانل کمتر بوده و همچنین رنگ حاصل به دلیل تبخیر سریع ایزوپروپانل پایدار نیست. در صورتی که حلالیت با DMSO بسیار بیشتر و رنگ حاصل نیز پایدارتر است.

برای استعلام قیمت و خرید پودر MTT و حلال های مورد نیاز کلیک نمایید

پروتکل انجام تست MTT

تست MTT به صورت تکرار سه تایی مطابق مراحل زیر انجام میشود: 

1- تهیه سوسپانسیون سلولی در رقت مناسب از سلولها که با شمارش سلولی حاصل میشود.

2- افزودن مقدار ۲۰۰ul از سوسپانسیون سلولی به هر چاهک پلیت ۹۶ خانه ای کشت سلولی برای این که در هر چاهک تقریبا تعداد ۱۰^۳×۵ سلول قرار گیرد انجام تست تریپان بلو و شمارش تعداد سلولها ضروری است.

3- انکوباسیون به مدت ۲۴ ساعت برای اطمینان از چسبیدن سلولها به بستر در انکوباتور ۵CO₂ و با رطوبت ۱۰۰%

4- پس از ۲۴ ساعت محیط کشت را از چاهک ها خارج کرده و اگر سلولها به کف پلیت چسبیده باشند میتوان با وارونه کردن پلیت این کار را انجام داد و اگر سلولها معلق باشند با استفاده از سانتریفوژهای مخصوص پلیت این کار انجام میشود. سپس ۲۰۰ul محیط کشت تازه به هر چاهک اضافه شود.

5- به هر چاهک ۲۰ul محلول رنگ MTT اضافه میشود پلیت در فویل آلومینیومی پوشیده شده و به مدت چهار ساعت در انکوباتور انکوبه می شود.

6- پس از طی زمان محیط کشت سلولها را خالی کرده و به هر چاهک  ۱۰۰ul از DMSO اضافه میکنیم.

7- با سمپلر، محیط و سلولها را خوب مخلوط میکنیم تا رنگ های فورمازان نامحلول حل شوند.

8- جذب نوری هر چاهک توسط اسپکتروفتومتر در طول موج ۵۷۰nm قرائت میشود.

9- در مقایسه با شاهد و کنترلهای مثبت و منفی میتوان منحنی های مربوطه را رسم نمود.